Desenvolvimento de um radioimunoensaio de dexametasona no soro como subsídio para o diagnóstico da síndrome de Cushing / Development of serum dexamethasone radioimmunoassay to corroborate Cushing's syndrome diagnosis

INTRODUÇÃO: O teste de supressão com 1 mg de dexametasona (TSDx) é amplamente empregado no rastreamento da síndrome de Cushing (SC) dada sua elevada acurácia diagnóstica. A SC é um distúrbio endocrinometabólico resultante do hipercortisolismo crônico com característica de ausência de supressão do cortisol no TSDx. OBJETIVO: Desenvolver um radioimunoensaio (RIE) para a dosagem de dexametasona (Dx) no soro para complementar o TSDx. MÉTODOS: Foram imunizados três coelhos com o conjugado dexametasona-21-hemissuccinato-BSA para escolha do melhor anticorpo e o RIE foi desenvolvido de acordo com as recomendações da RE 899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Analisamos 96 voluntários, sendo 67 submetidos ao TSDx e 29 não, e 12 pacientes com SC, estudados na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. RESULTADOS: O anticorpo contra Dx selecionado mostrou boa especificidade, coeficiente de variação (CV por cento) intra e interensaio < 20 por cento, exatidão de 93,8 por cento e dose mínima detectada de 19,5 ng/dl. A concentração de Dx no soro foi semelhante nos voluntários e pacientes com SC (ausência/supressão do cortisol): 205 a 703 ng/dl e 174 a 661 ng/dl (intervalo de confiança [IC] 95 por cento), respectivamente; os valores foram indetectáveis naqueles que não se submeteram ao teste. DISCUSSÃO: O anticorpo empregado apresenta boa afinidade e especificidade para quantificar a Dx no soro. O RIE mostrou reprodutibilidade e eficiência na determinação dos níveis séricos de Dx durante o TSDx. CONCLUSÃO: O presente RIE para a dosagem de Dx no soro é acurado e confiável, permitindo estabelecer uma faixa de referência de valores para subsidiar a interpretação do TSDx.

INTRODUCTION: The 1 mg dexamethasone suppression test (DxST) is widely used to screen Cushing's syndrome (CS) due to its high diagnostic accuracy. CS is an endocrine-metabolic disorder caused by hypercorticism, which is characterized by the absence of cortisol suppression in DxST. OBJECTIVE: To develop a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of serum dexamethasone (Dx) to complement DxST. METHODS: Three rabbits were inoculated with dexamethasone-21-hemisuccinate-BSA in order to choose the best antibody. Serum Dx RIA was performed according to RE 899/2003 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária [ANVISA]) regulations. Serum samples from 96 volunteers from Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) and Santa Casa de Misericórdia de São Paulo were analyzed, 67 of which were submitted to DxST and 29 were not. There were 12 patients with CS. RESULTS: The Dx antibody chosen showed good specificity. Intra- and interassay CV were < 20 percent with 93.8 percent accuracy and the lowest detection limit was 19.5 ng/dl. Serum Dx concentration was similar among both volunteers and CS patients (absence of cortisol suppression): 205 to 703 ng/dl and 174 to 661 ng/dl (95 percent CI), respectively. Values were undetectable among those that were not submitted to the test. Discussion: The anti-Dx antibody shows high specificity and reliability to quantify serum Dx in DxST. The Dx RIA presented reproducibility and reliability in the determination of serum Dx levels during DxST. CONCLUSION: The current RIA for serum Dx is accurate and reliable, which permits to establish a reference value range to substantiate DxST interpretation.

Superior discriminating value of ACTH-stimulated serum 21-deoxycortisol in identifying heterozygote carriers for 21-hydroxylase deficiency.

BACKGROUND: Congenital adrenal hyperplasia caused by classic 21-hydroxylase deficiency (21OHD) is an autosomal recessive disorder with a high prevalence of asymptomatic heterozygote carriers (HTZ) in the general population, making case detection desirable by routine methodology. HTZ for classic and nonclassic (NC) forms have basal and ACTH-stimulated values of 17-hydroxyprogesterone (17OHP) that fail to discriminate them from the general population. 21-Deoxycortisol (21DF), an 11-hydroxylated derivative of 17OHP, is an alternative approach to identify 21OHD HTZ. OBJECTIVE: To determine the discriminating value of basal and ACTH-stimulated serum levels of 21DF in comparison with 17OHP in a population of HTZ for 21OHD (n = 60), as well as in NC patients (n = 16) and in genotypically normal control subjects (CS, n = 30), using fourth generation tandem mass spectrometry after HPLC separation (LC-MS/MS). RESULTS: Basal 21DF levels were not different between HTZ and CS, but stimulated values were increased in the former and virtually nonresponsive in CS. Only 17·7% of the ACTH-stimulated 21DF levels overlapped with CS, when compared to 46·8% for 17OHP. For 100% specificity, the sensitivities achieved for ACTH-stimulated 21DF, 17OHP and the quotient [(21DF + 17OHP)/F] were 82·3%, 53·2% and 87%, using cut-offs of 40, 300 ng/dl and 46 (unitless), respectively. Similar to 17OHP, ACTH-stimulated 21DF levels did not overlap between HTZ and NC patients. A positive and highly significant correlation (r = 0·846; P < 0·001) was observed between 21DF and 17OHP pairs of values from NC and HTZ. CONCLUSION: This study confirms the superiority of ACTH-stimulated 21DF, when compared to 17OHP, both measured by LC-MS/MS, in identifying carriers for 21OHD. Serum 21DF is a useful tool in genetic counselling to screen carriers among relatives in families with affected subjects, giving support to molecular results.

[The importance of methodology in serum testosterone measurement: comparison between a direct immunoassay and a method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS)]. / Importância da metodologia na dosagem de testosterona sérica: comparação entre um imunoensaio direto e um método fundamentado em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS).

Serum testosterone in its total or free form, is a highly valuable diagnostic test and is available in the great majority of clinical laboratories. This reality was possible due to the development of simple and direct assays, adaptable to large automatic systems. Recent publications have called attention to the limitations of these simplified methodologies, mainly in samples with low concentration, as women and children. In this paper we present results obtained using a reference method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) and its comparison with those obtained with a commercial routine immunoassay (electrochemiluminescent assay, ECLIA). Methods were compared in total testosterone measurement (n = 213), as well as in free testosterone evaluation based on calculation including sex hormone-binding protein (SHBG) levels (n = 135). Values obtained with ECLIA were significantly higher, with more marked dispersion in low concentration. This phenomenon is clearer when presented as a Bland-Altman plot. Difficulties in the implementation of reference methods as the one presented are discussed, as well as the necessity of caution in the interpretation of values obtained with routine assays, a matter of several publications in recent literature.

Importância da metodologia na dosagem de testosterona sérica: comparação entre um imunoensaio direto e um método fundamentado em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS) / The importance of methodology in serum testosterone measurement: comparison between a direct immunoassay and a method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS)

A dosagem de testosterona sérica, total ou fração livre, é metodologia de alto valor diagnóstico e encontra-se disponível na maioria dos laboratórios clínicos. Esta disponibilidade foi possível pelo desenvolvimento de metodologias simples e diretas, adaptáveis a plataformas de dosagem automatizada. Uma série de publicações recentes tem alertado quanto às limitações destas metodologias, em especial em amostras com baixas concentrações, como mulheres e crianças. Neste trabalho serão apresentados os resultados do emprego de uma metodologia de referência, fundamentada em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS), e sua comparação com uma dosagem de rotina (ensaio eletroquimioluminescente - ECLIA). Os métodos são comparados tanto na dosagem de testosterona total (n = 213) quanto na determinação de testosterona livre calculada com base na determinação da testosterona total e da proteína carregadora de hormônios sexuais (SHBG) (n = 135). Os valores obtidos com o ECLIA são significativamente mais elevados, sendo a dispersão mais nítida em soros com baixas concentrações. Tal fenômeno fica mais claro quando apresentado na forma de gráficos de Bland-Altman. Neste trabalho são discutidas as dificuldades de implementação de uma metodologia de referência, como a apresentada, e a convivência com as metodologias de rotina, bem como a literatura recente sobre o assunto.

Serum testosterone in its total or free form, is a highly valuable diagnostic test and is available in the great majority of clinical laboratories. This reality was possible due to the development of simple and direct assays, adaptable to large automatic systems. Recent publications have called attention to the limitations of these simplified methodologies, mainly in samples with low concentration, as women and children. In this paper we present results obtained using a reference method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) and its comparison with those obtained with a commercial routine immunoassay (electrochemiluminescent assay, ECLIA). Methods were compared in total testosterone measurement (n = 213), as well as in free testosterone evaluation based on calculation inclu-ding sex hormone-binding protein (SHBG) levels (n = 135). Values obtained with ECLIA were significantly higher, with more marked dispersion in low concentration. This phenomenon is clearer when presented as a Bland-Altman plot. Difficulties in the implementation of reference methods as the one presented are discussed, as well as the necessity of caution in the interpretation of values obtained with routine assays, a matter of several publications in recent literature.

[Measurement of free urinary cortisol and cortisone using liquid chromatography associated with tandem mass spectrometry method]. / Dosagem de cortisol e cortisona livres urinários empregando cromatografia líquida associada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Free urinary cortisol (UFF) measurement is one of the most useful screening tests for Cushing's syndrome. Immunoassays employed today by most clinical laboratories present limitations, specially concerning specificity. These limitations restrain a widespread application of the method, as well as the comparison of results obtained by the use of different methods. We present the development and characterization of a UFF and cortisone method based on liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A 200 microL aliquot from a 24 h urine sample is mixed with a solution containing a known quantity of deuterated cortisol and on-line extracted in solid phase (C18). The eluate is transferred to a second C18 column (Phenomenex Luna, 3 micro, 50 x 2 mm) and the isocratic mode elution profile is directly applied to a tandem mass spectrometer model Quattro Micro operating in positive mode atmospheric pressure chemical ionization (APCI). All process is automated and the quantification is performed by isotopic dilution, based on the analyte and the deuterated internal standard peak area ratios. The specificity study showed that all the steroids tested presented cross reactivity of <1% for cortisol and cortisone. Functional sensitivity is <1 microg/L for both steroids, and the interassay CV <8%. Recovery and linearity studies were satisfactory and comparison of results obtained using a RIA for UFF and the present method in 98 routine samples showed a correlation of r= 0.838, with the results obtained with LC-MS/MS significantly lower (medians of 22.0 vs. 49.4 microg/24 h for RIA) (P<0.0001). Reference values for cortisol were defined as values between 11 and 43 microg/24 h, compatible to those recently described for similar methods. The concomitant measurement of UF cortisone allows the study of the activity of the enzyme 11beta-HSD2 and the diagnosis of the apparent mineralocorticoid excess syndrome. The method represents the first steroid assay of a new generation, based on automated preparative methods and tandem mass spectrometry, described in our country.

Dosagem de cortisol e cortisona livres urinários empregando cromatografia líquida associada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) / Measurement of free urinary cortisol and cortisone using liquid chromatography associated with tandem mass spectrometry method

A dosagem de cortisol livre na urina (CLU) é um método útil na triagem de pacientes suspeitos de síndrome de Cushing. Os imunoensaios atuais apresentam limitacões que dificultam sua aplicacão e a comparacão de resultados por diferentes ensaios. No presente método para dosagem de cortisol e cortisona livres urinários, baseado em cromatografia líquida com deteccão por espectrômetro de massa em tandem (LC-MS/MS), uma alíquota de urina 24h (200æL) é misturada com solucão contendo quantidade conhecida de cortisol deuterado e extraída on-line em fase sólida (C18). O eluato é transferido para uma segunda coluna C18 (Phenomenex Luna, 3æ, de 50 x 2mm), e o eluato obtido em modo isocrático é aplicado diretamente no MS/MS modelo Quattro Micro, operando no modo positivo de ionizacão química a pressão atmosférica (APCI). Todo o processo é automatizado e a quantificacão é feita por diluicão isotópica com base nas razões das áreas dos picos dos analitos e do padrão interno deuterado. O estudo de especificidade mostrou que nenhum esteróide testado apresenta reatividade cruzada superior a 1 por cento com cortisol ou cortisona. A sensibilidade funcional é <1æg/L para os dois esteróides, e o CV interensaio <8 por cento. Os estudos de recuperacão e de linearidade foram satisfatórios, e a comparacão entre os resultados obtidos para cortisol em 98 amostras de rotina, pelo ensaio em estudo e por um RIE, mostraram correlacão de r= 0,838, sendo os valores obtidos por LC-MS/MS significativamente mais baixos (medianas de 22,0 e 49,4æg/24h, respectivamente) (P<0,0001). Os valores de referência para cortisol foram definidos entre 11 e 43æg/24h, compatíveis com métodos semelhantes recentemente descritos. A dosagem concomitante de cortisona livre urinária permite o estudo da atividade da enzima 11beta-HSD2 e a pesquisa da síndrome do excesso aparente de mineralocorticóides. O método descrito representa a primeira descricão, em nosso meio, de uma nova geracão de métodos para a medida de esteróides hormonais, baseados em processos preparativos automatizados e leitura por espectrometria de massa em tandem.

Aplicaçäo da cromatografia líquida de alta performance como método preparativo para a dosagem de esteróides hormonais por RIE: dosagens de 17OH-progesterona e diidrotestosterona / Application of the high performance liquid chromatography as a preparative method for the hormonal steroid dosage for RIE: 17OH-progesterone and dihydrotestosterone dosages

A dosagem dos esteróides hormonais tem apresentado evoluçäo técnica significativa, sendo' os principais esteróides de interesse clínico dosados, atualmente, por métodos simples, rápidos e automatizados. Existe, no entanto, um compromisso em detrimento da exatidäo, que é mais evidente na determinaçäo de esteróides de menor concentraçäo relativa e maior número de interferentes potenciais, como a 17-hidroxiprogesterona (170HP), a diidrotestosterona (DHT) e outros. Nestes casos, um processo preparativo versátil e robusto é fundamental para garantir resultados com alto grau de exatidäo. Apresentamos a padronizaçäo de um processo preparativo baseado em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) comparado à cromatografia em coluna de celite para a dosagem de 170HP e DHT. Os anticorpos empregados nos respectivos radioimunoensaios apresentam especificidade semelhante aos descritos na literatura. As amostras foram inicialmente extraídas em éter etílico e em seguida submetidas ao processo cromatográfico. Amostras de soro provenientes da rotina foram dosadas em paralelo pelos dois métodos, sendo 57 amostras para 170HP e 84 para DHT. Näo houve diferença significativa entre os resultados, e os índices de correlaçäo foram elevados (R= 0,95 e 0,97). Os resultados comprovam que a aplicaçäo do HPLC é válida, além de ser mais reprodutível, versátil e menos operador-dependente. Sua aplicaçäo mais ampla permitirá uma melhora de exatidäo na dosagem de esteróides de baixa concentraçäo relativa, onde os métodos mais simples resultam em valores falsamente elevados.